ỨNG DỤNG KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH VÀNG LÁ

TRÊN CÂY CÓ MÚI

Viện Bảo vệ thực vật

1. Lời mở đầu

1. Đặt vấn đề

Cây có múi thuộc nhóm 15 loại quả chủ lực, có diện tích và sản lượng lớn nhất (trên 20 nghìn ha mỗi loại) của nước ta. Tổng diện tích cây có múi cả nước đến hết năm 2019 đạt 256,86 nghìn ha, chiếm 24,07% tổng diện tích cây ăn quả.  

Tuy nhiên, trong những năm gần đây nhiều diện tích trồng cây có múi có xu hướng giảm mạnh, cây nhanh chóng bị suy thoái, cây giảm sinh trưởng, phát triển, năng suất kém hoặc không cho năng suất. Nhiều vùng cam đã giảm tới 50% diện tích do phá bỏ hoặc chuyển đổi sang cây trồng khác: tại Nghệ An từ 5464 ha diện tích trồng giảm mạnh đến đầu năm 2023 diện tích trồng thực tế chỉ còn khoảng 2500 ha (Chi cục TT và BVTV Nghệ An), xã Bình Sơn (Lục Nam, Bắc Giang) phải phá bỏ 70 ha trên tổng diện tích 120 ha cây có múi; huyện Hàm Yên năm 2021 trồng hơn 8000 ha, diện tích giảm liên tục còn khoảng 4500 ha cuối năm 2022 (trung tâm cây ăn quả Hàm Yên) hay Cao Phong - Hòa Bình từ 2530 ha (năm 2020) đến nay giảm còn 1357,4 ha; có một số vùng gần 90% diện tích bị bệnh đã bị chặt bỏ.

Đến nay, nhiều nguyên nhân gây suy thoái cây cam đã được nghiên cứu và công bố bao gồm: (i) do cây giống nhiễm bệnh, (ii) đất đai bị thoái hóa, thay đổi kết cấu, (iii) do sâu bệnh phát sinh gây hại và (iv) do người dân bón phân và chăm sóc sai cách, không theo quy trình khuyến cáo. Trong đó, bệnh vàng lá greening hay còn gọi là bệnh HLB là bệnh phổ biến và đặc biệt nguy hiểm đối với các loài thuộc chi Citrus. Kết quả điều tra các vùng sản xuất cam quýt trọng điểm như Nghệ An, Hoà Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Tiền Giang, Hậu Giang, Cần Thơ trồng cây có múi có tỷ lệ nhiễm cao 20 - 50%, tại Phủ Quỳ - Nghệ An, bệnh vàng lá greening chiếm đến 90% các vườn bị vàng lá và được xác đinh là nguyên nhân gây suy thoái chính. Bệnh gây ra bởi vi khuẩn gram âm “Candidatus liberibacter asiaticus” (CLas) tấn công theo mạch dẫn của cây, lây lan qua mắt ghép và rầy. Vi khuẩn CLas sau xâm nhiễm tập trung, nhân lên và phá hủy vùng rễ 30-50% rễ tơ (Johnson và cộng sự 2014) trước khi di chuyển lên trên lá gây cản trở sự di chuyển dinh dưỡng và gây ra các triệu chứng vàng lá.

Cho đến nay, chưa có biện pháp nào hiệu quả để chữa trị các cây bị nhiễm bệnh vàng lá greening. Quản lý bệnh chủ yếu tập trung vào cây giống sạch bệnh, tiêu diệt môi giới truyền bệnh và quan trọng là loại bỏ cây bị nhiễm CLas. Trên đồng ruộng, dù thực hiện việc quản lý rầy bằng các biện pháp canh tác, hóa học…thì sau 5 năm tỷ lệ tái nhiễm vẫn là 17 - 20%. Vì vâỵ, việc xác định chính xác, kịp thời thời rất quan trọng. Hiện nay, việc phát hiện cây nhiễm CLas dựa vào triệu chứng thì thường muộn, kém chính xác do nhầm lẫn triệu chứng vàng lá greening với vàng lá thối rễ, vàng do thiếu dinh dưỡng; dựa trên kỹ thuật PCR bị ảnh hưởng nhiều vào số lượng và phân bố của vi khuẩn trên cây bị nhiễm. Hơn nữa, để theo dõi dịch bệnh thì khả năng xử lý hàng nghìn mẫu sử dụng phương pháp PCR hạn chế đòi hỏi nhiều công sức, thời gian, chi phí và trang thiết bị. Do đó, các kỹ thuật chẩn đoán nhanh và đáng tin cậy cho phép xác định chính xác và kịp thời các cây bị nhiễm bệnh là nhu cầu cấp thiết để có thể quản lý dịch bệnh greening một cách hiệu quả.

  Do vậy việc nghiên cứu và ứng dụng KIT chẩn đoán nhanh giúp xác định hiện tượng vàng lá Greening để có giải pháp phục hồi là cần thiết trong giai đoạn hiện nay

1.2. Giới thiệu về kit chẩn đoán nhanh

• KIT iodine

Thử nghiệm Iodine đã được phát triển bởi Tsai (2007) và Su (2008) được cho là có hiệu quả phát hiện bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi. Cơ sở khoa học của phương pháp này là lá của cây bị nhiễm bệnh greening bị rối loạn chuyển hóa tinh bột thành đường, vì vậy mà lượng tinh bột cây hấp thụ có xu hướng tích lũy trong lá. Thông qua phản ứng giữa tinh bột với dung dịch Iodine sẽ chuyển thành dung dịch màu đen sẽ giúp phân biệt cây bị nhiễm bệnh greening trên đồng ruộng. Viện Bảo vệ thực vật đã được GS. Hong Ji Su chuyển giao cho kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening bằng dung dịch Iodine, từ đó Viện đã hoàn thiện KIT Iodine và ứng dụng khắp các vùng trồng cây ăn quả có múi. Ưu điểm của kỹ thuật này là cho kết quả nhanh, thực hiện ngay trên đồng ruộng với 3 bước đơn giản: (1) lấy miếng giấy giáp chà lên mặt trên của lá, (2) cho nước cất vào tạo dung dịch mà xanh, (3) nhỏ dung dịch test, nếu dung dịch có màu vàng hay xanh nhạt cho kết quả âm tính và nếu dung dịch chuyển màu đen cho kết quả dương tính với bệnh vàng lá greening.

• Kỹ thuật DTBIA (direct tissue blot immunoassay)

  Trong khuôn khổ của đề tài, gen mã hóa protein tiết SDE1 (Sec-Delivered Effector 1) đã được phân lập từ chủng gây bệnh ở Việt Nam và tái tổ hợp trong tế bào E. coli. Kháng thể đa dòng đặc hiệu cho protein SDE1 đã được sản xuất và tinh sạch. Sử dụng các kháng thể đa dòng trên, nhóm nghiên cứu đã phát triển thành công kỹ thuật màng sử dụng trực tiếp mô cây để phát hiện được cây có múi bị bệnh greening ở giai đoạn sớm. Nguyên lý của kỹ thuật màng (Direct Tissue Blot Immunoassay) là phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên đặc hiệu xuất hiện trong dịch mô cây bệnh và được cố định trên màng nitrocellulose.  SDE1 là một loại protein tiết của vi khuẩn HLB gây bệnh vàng lá greening vào mạch cây. Dựa trên đặc điểm này, có thể chẩn đoán cây nhiễm bệnh vàng lá greening thông qua xác định sự có mặt của protein SDE1. Đề tài đã phát triển thành công kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu với kháng nguyên SDE1 để phát hiện protein SDE1 trong cành non của mẫu cây bệnh sau khi được cố định trên màng nitrocellulose.  Kỹ thuật chẩn đoán này có khả năng xử lý mẫu trực tiếp ngoài hiện trường, sử dụng dịch chiết của cây đưa lên màng, chi phí giảm so với kỹ thuật PCR, không yêu cầu trang thiết bị đặc biệt.2. 

2. Kết quả và thảo luận

2.1. Hiện tượng vàng lá trên cây cam

Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật, các vùng đều có diện tích cây cam bị vàng lá (từ 20 - 50 %), năng suất, sinh trưởng kém, chủ yếu là các vùng trồng độc canh thuộc chu kỳ 2, 3; độ tuổi cây từ 4 - 10 năm tuổi. Biểu hiện vàng lá chính bao gồm: chồi vàng, lá vàng lốm đốm, vàng lá cục bộ, vàng toàn bộ lá, vàng lá gân xanh. Các triệu chứng khác trên cây bị vàng như tán thưa, khô cành, thối rễ, rụng lá, quả, giảm năng suất và cây kém phát triển, năng suất kém.

2.1.1. Ứng dụng KIT Iodine và kỹ thuật DTBIA xác định nhóm triệu chứng vàng vàng lá do cây nhiễm CLas

Các biểu hiện vàng lá khác nhau trên cây ăn quả có múi đã được xác định do rất nhiều nguyến nhân gây ra: bệnh vàng lá thối rễ (do nhóm các vi sinh vật có hại tồn tại trong đất), vàng lá do thiếu dinh dưỡng do bộ rễ bị ảnh hưởng (cây bị ngộ độc do phân bón và ngập úng, do đất bị thoái hóa đều làm bộ rễ kém phát triển) và vàng lá do thiếu các vi lượng như sắt, magie, kẽm... Các biểu hiện vàng lá greening dễ nhầm với các nhóm trên nên cần được xác định chính xác thông qua các kỹ thuật chẩn đoán nhanh. Ứng dụng KIT Iodine và kỹ thuật DTBIA trên các nhóm triệu chứng vàng khác nhau, kết quả được so sánh với kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy, 2 kỹ thuật đều phân biệt được vàng lá greening với các biểu hiện vàng lá khác. Cho thấy, đây là những công cụ giúp người sản xuất nhận biết và loại bỏ sớm cây bị vàng lá greening trên đồng ruộng, giúp kéo dài tuổi thọ và thời gian cho năng suất của cây có múi.

Bảng 1. Ứng dụng kỹ thuật DTBIA và KIT Iodine xác định nhóm triệu chứng vàng lá do nhiễm CLas trên cây cam (Viện BVTV, 2022)

Ghi chú: Kí hiệu “+” mẫu bị bệnh; “-” mẫu không bị bệnh

Như vậy, kỹ thuật DTBIA và KIT Iodine đã giúp phân biệt các triệu chứng bệnh vàng lá greening, cụ thể được mô tả như sau:

Trên lá: Bệnh vàng lá greening biểu hiện rõ trên lá và quả, ngoài ra trên rễ bệnh làm khối lượng rễ tơ từ 30 -50%. Trên lá phân thành 5 dạng biểu hiện chính gồm: Lá non vàng nhỏ hẹp (tai thỏ), vàng lá lốm đốm (lá vàng đốm xanh hoặc lá xanh đốm vàng), vàng lá cục bộ, vàng lá gân xanh và vàng toàn bộ, lá cứng giòn.

Hình 1. Các biểu hiện vàng trên lá cây cam

(A-H): lá bị nhiễm bệnh greening. (A) triệu chứng tai thỏ, lá hẹp trên lá non; (B, C) vàng lá gân xanh; (D, H) vàng lá cục bộ; (E, F) vàng lá lốm đốm (đốm vàng trên nền xanh hoặc đốm xanh trên nền vàng); (G) vàng toàn bộ lá. (I) vàng do thối rễ và (J) thiếu dinh dưỡng).

Trên quả: trên cây bệnh quả nhỏ có vị đắng, độ ngọt giảm, méo mó, lệch tâm và xuất hiện hiện tượng chín ngược (vùng vỏ cuống quả biến vàng, phần dưới quả màu xanh), hạt bị đen lép và quả có thể bị rụng từ khi non đến khi thu hoạch.

Trên cây: nhiễm bệnh vàng lá greening trở nên yếu, còi cọc, ra hoa trái vụ, gây hiện tượng rụng lá, chết cành. Hệ thống rễ bị giảm dần, khối lượng rễ gây suy giảm sức sống của cây, bệnh nặng dẫn đến khô cành, chết toàn bộ cây. Bệnh vàng lá greening khó phân biệt bằng mắt thường với vàng lá do một số tác nhân khác như vàng lá thối rễ và vàng do cây thiếu dinh dưỡng.

Hình 2. Triệu chứng bệnh vàng lá greening

(A) Cây bị vàng và khô cành; (B) Quả bị lệch tâm, hạt lép đen; (C) Hiện tượng quả chín ngược trên cây nhiễm bệnh

2.2. Ứng dụng KIT Iodine và kỹ thuật DTBIA chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening trên đồng ruộng

2.2.1. Ứng dụng KIT Iodine và kỹ thuật DTBIA chẩn đoán bệnh vàng lá greening trên các độ tuổi lá khác nhau

Tuổi lá có ảnh hưởng tới khả năng chuyển hóa, tích lũy tinh bột và mật độ vi khuẩn CLas trong cây, bởi vậy sẽ ảnh hưởng tới kết quả chẩn đoán bệnh greening bằng KIT Iodine và kỹ thuật DTBIA.

Với KIT Iodine, thực hiện chẩn đoán bệnh vàng lá greening trên các lá có độ tuổi khác nhau: lá non, lá bánh tẻ, lá già và lá của cây không nhiễm bệnh (được xác định bằng kỹ thuật PCR) của cây bị nhiễm bệnh. Kết quả cho thấy, sử dụng lá bánh tẻ và lá già là thích hợp nhất khi chẩn đoán bệnh bằng greening KIT Iodine, dung dịch phản ứng chuyển màu đen đậm, đối chứng không chuyển màu. Thử nghiệm trên lá non là khó thực hiện và chuyển màu đen nhạt khó phân biệt âm và dương tính.

Bảng 2. Kết quả đánh giá độ tuổi thích hợp của lá đến hiệu quả chẩn đoán bệnh KIT Iodine

CT1: Lá non; CT2: Lá bánh tẻ; CT3: Lá già; CT4: Đối chứng (Lá cây khỏe)

Đối với kỹ thuật DTBIA, Phương pháp xác định cây bị bệnh dựa trên phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên SDE1 (một loại protein tiết của vi khuẩn gây bệnh greening vào cây) và kháng thể đa dòng SDE1 đã tạo được. Bề mặt lát cắt của chồi được ấn nhẹ lên màng nitrocellulose. Màng này sau đó được ủ với kháng thể kháng SDE1a và mẫu nhiễm bệnh được phát hiện với cơ chất. Ứng dụng kỹ thuật này đánh giá ảnh hưởng độ tuổi của lá đến hiệu quả chẩn đoán bệnh greening bằng kỹ thuật DTBIA, kết quả được chụp trên kính hiển vi soi nổi độ phóng đại 10x, thấy rằng kĩ thuật DTBIA đều nhận biết được bệnh trên các chồi có độ tuổi khác nhau. Tuy nhiên, chồi có độ tuổi 3-6 tháng thích hợp nhất cho việc chẩn đoán vết in lát cắt trên màng nitrocellulo chuyển màu đen rõ ràng, chồi quá già (trên 6 tháng) thao tác cắt khó và các chồi quá non (0,5-2 tháng tuổi) không thích hợp cho thử nghiệm.   

Hình 3. Kết quả chẩn đoán bệnh Greening bằng kỹ thuật DTBIA trên các tuổi chồi khác nhau

(A-G). Kết quả trên các chồi nhiễm bệnh. (A) Chồi 1 tháng tuổi; (B) chồi 2 tháng tuổi; (C-E) chồi từ 3-6 tháng tuổi;(F-G) chồi >6 tháng tuổi; (H) chồi không nhiễm bệnh

2.2.2. Ứng dụng kỹ thuật DTBIA và KIT Iodine chẩn đoán bệnh greening cho các vườn cam tại Hòa Bình và Nghệ An

Ứng dụng kỹ thuật DTBIA và KIT Iodine chẩn đoán bệnh greening cho các vườn cam tại Hòa Bình và Nghệ An, 340 mẫu có các biểu hiện vàng lá và các mẫu lá tại các vị trí xung quanh cây bị vàng được thu thập và được phân tích bởi các kỹ thuật chẩn đoán bệnh greeing (kỹ thuật DTBIA và KIT Iodine) trên cây ăn quả có múi. Kết quả tại bảng 3 và bảng 4.

Bảng 3. Kết quả phân tích bệnh vàng lá greening trên các mẫu lá cam bằng kỹ thuật DTBIA thu thập tại các tỉnh Hòa Bình, Nghệ An (2022)

Kết quả phân tích bằng kỹ thuật PCR xác định trong 340 mẫu lá thu thập tại 2 tỉnh gồm Hòa Bình và Nghệ An được giám định đã xác định được 216 mẫu dương tính với bệnh tỷ lệ nhiễm cao từ 57,8 - 66,7%. Các mẫu có biểu hiện vàng lá khác nhưng âm tính có thể bị bệnh vàng lá thối rễ hoặc thiếu dinh dưỡng. Phân tích bằng kỹ thuật DTBIA xác định được 195/340 mẫu dương tính, số mẫu không phát hiện được là các mẫu không hoặc ít biểu hiện triệu chứng. Như vậy, độ chính xác của DTBIA trung bình đạt 90,3% so với PCR.

Khi phân tích các mẫu thu thập được, KIT Iodine xác định được 166/340 mẫu nhiễm vi khuẩn CLas tương đương độ chính xác đạt 76,6% so với kỹ thuật PCR, các mẫu không phát được chủ yếu là không hoặc ít biểu hiện triệu chứng. Tuy nhiên, KIT Iodine có hiệu quả phân biệt các triệu chứng vàng do greening và các biểu hiện vàng lá khác ngay trên hiện trường, cho kết quả nhanh góp phần chọn lọc mẫu trước khi đưa về phòng thí nghiệm phân tích.

Bảng 4. Kết quả phân tích bệnh vàng lá greening trên các mẫu lá cam bằng KIT Iodine thu thập tại các tỉnh Hòa Bình, Nghệ An (2022)

3. Thảo luận

Việc xác định được các chỉ thị sinh học mới để chẩn đoán sớm bệnh greening đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng chống lại căn bệnh này trên cây có múi.

Lợi thế của việc sử dụng các protein tiết làm chỉ thị sinh học để chẩn đoán HLB nằm ở vi khuẩn gây bệnh greening sống trong mạch rây, là hệ mạch vận chuyển sản phẩm quang hợp để nuôi cây. Sau khi tiết được tiết ra từ tế bào vi khuẩn, protein tiết bởi vi khuẩn gây bệnh có thể được vận chuyển theo mạch dẫn và làm gia tăng phân bố của tác nhân gây bệnh trên các cây bị nhiễm bệnh (Prasad và cs, 2016).  Mặc dù chưa xác định sự phân bố cụ thể của các protein tiết này trong cây có múi, nhưng đã có bằng chứng là protein tiết của của nhiều tác nhân gây bệnh đã được di chuyển vị trí lây nhiễm đến các mô phân sinh và cả các mô lân cận thông qua dịch gian bào (Shi và cs, 2019).  Do đó, chẩn đoán dựa trên protein tiết là một hướng mới có thể giải quyết nhưng khó khăn bởi sự phân bố hẹp của tế bào vi khuẩn trên cây có múi và phải thu thập đúng mẫu mô chứa tế bào vi khuẩn hoặc DNA. Sử dụng kháng thể đặc hiệu cho các protein tiết của vi khuẩn có thể là lựa chọn bổ sung cho kỹ thuật chẩn đoán PCR nhằm làm tăng cơ hội xác định các cây bị nhiễm bệnh, đặc biệt là ở giai đoạn sớm, cây chưa có triệu chứng, cho phép tiến hành các cuộc khảo sát trên quy mô lớn với chi phí giảm.

So với PCR, xét nghiệm phát hiện dựa trên kháng thể nói chung nhanh hơn và tiết kiệm chi phí hơn (Sankaran và cs, 2010). Hơn nữa, từ một kháng thể có thể sử dụng các phương pháp chuẩn đoán khác nhau. Ví dụ, phương pháp dot-blot hoặc mô cây trực tiếp (DTBIA) đơn giản, nhanh chóng và dễ sử dụng, thích hợp cho việc khảo sát thực địa quy mô lớn. Phương pháp này không yêu cầu xử lý mẫu, loại bỏ nhu cầu về thiết bị phòng thí nghiệm ngay cả cối nghiền mẫu. Việc quản lý bệnh vàng lá greening bằng việc quản lý môi giới hiệu quả không cao do rầy chổng cánh truyền bệnh nhanh và di chuyển qua các vườn các vùng. Bởi vậy, việc sử dụng các kỹ thuật như PCR hay DTBIA cho phép phát hiện và loại bỏ sớm cây nhiễm bệnh khi cây chưa biểu hiện triệu chứng, góp phần giảm nguồn bệnh, chống tái nhiễm trên đồng ruộng.

Như vậy, các công cụ chẩn đoán của Viện Bảo vệ thực vật thích hợp phân tích mẫu với các mục tiêu khác nhau. Trong phòng thí nghiệm, kỹ thuật PCR phù hợp phân tích lượng mẫu ít như cây đầu dòng So, tuyển chọn cây đầu dòng; kỹ thuật DTBIA sẽ phân tích lượng mẫu lớn, trong thời gian ngắn như phân tích cây giống trước khi xuất vườn. Ngoài hiện trường, KIT Iodine cho phép phân biệt triệu chứng vàng lá do greening và vàng lá do các nguyên nhân khác, cho kết quả nhanh góp phần chọn lọc mẫu trước khi đưa về phòng thí nghiệm phân tích.

4. Kết luận

Nghiên cứu này đã xác định các nhóm triệu chứng trên lá, quả, rễ và toàn cây bệnh vàng lá greening. Kỹ thuật DTBIA (direct tissue blot immunoassay) và KIT Iodine đã được ứng dụng và phát hiện thành công các mẫu nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi, phục vụ phân tích lượng mẫu lớn, cho kết quả nhanh, chi phí thấp.            Trong năm 2022, sử dụng các kỹ thuật PCR phát hiện 216/340 mẫu nhiễm bệnh tại hai tỉnh Hòa Bình và Nghệ An, cho thấy bệnh greening là một trong những nguyên nhân chính gây hiện tượng vàng lá trên cây cam (57,8 - 66,7%).

Phân tích bằng kỹ thuật DTBIA xác định được 195/340 mẫu dương tính và KIT Iodine là 166/340, độ chính xác lần lượt là 90,3% và 76,6% so với PCR; số mẫu không phát hiện được là các mẫu không hoặc ít biểu hiện triệu chứng.

Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí từ Đề tài “Nghiên cứu sản xuất KIT chẩn đoán bệnh vàng lá greening và bệnh tàn lụi (CTV) trên cây có múi” thuộc chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp giai đoạn 2016-2020.

Chi tiết xem file đính kèm: ỨNG DỤNG KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH VÀNG LÁ TRÊN CÂY CÓ MÚI